Comment lire un rapport de lot BTLabs

Un rapport de lot est le seul document permettant de vérifier si le vial contient bien ce qui est indiqué sur l'étiquette. Pourtant, il s'agit le plus souvent d'un fichier PDF que personne n'ouvre, faute de savoir précisément ce qu'il contient. Vous trouverez ci-dessous la signification des différentes sections d'un rapport de BTLabs, la méthode pour relier le rapport au vial en votre possession et les limites intrinsèques du document.

Deux mesures, deux questions distinctes

Un rapport de BTLabs comporte deux types d'analyses, qu'il convient de distinguer. La HPLC (chromatographie en phase liquide) sépare l'échantillon en ses différents constituants et quantifie la proportion de chacun. Cela donne le taux de pureté : le pourcentage de matière dans le vial correspondant à la substance ciblée.

La mesure de l'identité répond à une autre question : s'agit-il bien de la bonne substance ? Sur les rapports actuels de BTLabs, cette vérification est effectuée par FTIR, une forme de spectroscopie infrarouge. Le spectre de l'échantillon doit présenter les bandes d'absorption caractéristiques du peptide. De nombreux autres laboratoires utilisent pour cela la spectrométrie de masse, qui mesure la masse moléculaire et la compare à la masse théorique. La méthode pour lire un tel spectre de masse, incluant la masse attendue et la masse mesurée, est détaillée dans Pureté, HPLC et spectrométrie de masse.

Ces deux types d'analyses ne sont pas interchangeables. Un échantillon peut présenter une pureté de 99 % tout en contenant le mauvais composé : 99 % de son contenu est alors constitué d'une seule et même substance, mais pas celle recherchée. Un taux de pureté sans analyse d'identité concomitante a donc une portée plus limitée qu'il n'y paraît.

L'en-tête du rapport : identifier le vial testé

La partie supérieure regroupe les données reliant le rapport à un échantillon concret et spécifique. Lisez-les en premier lieu, car l'ensemble des données qui suivent ne s'applique qu'à cet échantillon précis.

• Report # : le numéro de rapport propre à BTLabs. Ce numéro sert à vérifier l'authenticité du rapport auprès du laboratoire.
• Lot Number : le numéro de lot de la série. Ce numéro doit figurer à l'identique sur l'étiquette du vial que vous détenez.
• BT Sample ID : le code d'identification interne de l'échantillon au sein du laboratoire.
• Testing material et Labeled as : le nom de la substance tel qu'il a été transmis et tel qu'il apparaît sur l'étiquette.
• Labeled Peptide Content : la quantité de peptide indiquée sur l'étiquette, par exemple 5 mg.
• Tested et Date : la date à laquelle les mesures ont été effectuées et la date d'émission du rapport.
• Visual Description : l'aspect du vial à sa réception : poudre, étiquette et opercule.

Si le numéro de lot ne correspond pas, vous consultez le rapport d'un autre lot, qui n'apporte aucune information sur votre matériel. C'est pourquoi nos rapports sur Rapports de laboratoire sont consultables par numéro de lot plutôt que par le seul nom de la substance. La vérification commence par le numéro inscrit sur le verre.

Le tableau d'analyse, ligne par ligne

Le cœur du rapport est constitué d'un tableau à quatre colonnes : l'analyse, la méthode, la spécification et le résultat mesuré. La colonne relative à la méthode fait référence à un chapitre de la pharmacopée américaine (USP), c'est-à-dire la méthode normalisée employée pour la mesure.

• General Appearance : un contrôle visuel. La spécification est par exemple "white powder", et le résultat indique si l'échantillon y est conforme.
• Mass : la pesée du contenu tel que reçu.
• FTIR Identification and Composition Analysis : la détermination de l'identité. Le résultat confirme si le spectre correspond au peptide et précise parfois la présence d'excipients ou d'agents de charge dans la poudre.
• HPLC Purity : la pureté exprimée en pourcentage, accompagnée de la spécification requise, par exemple au minimum 98 %.
• HPLC Potency Assay : le dosage quantitatif. La quantité de peptide réellement présente dans le vial en milligrammes, sous forme de valeur absolue et de pourcentage par rapport à l'étiquette. La spécification se situe généralement entre 90 et 110 % de la valeur déclarée sur l'étiquette.
• Peptide-to-Excipients Ratio : le ratio entre le peptide et les excipients au sein de la poudre.

La pureté et la teneur (dosage) sont souvent confondues, mais il s'agit de grandeurs distinctes. La pureté indique quelle part du matériel peptidique correspond à la molécule ciblée. La teneur indique la quantité réelle de cette substance dans le vial. Un échantillon peut avoir une pureté de 99 % tout en contenant moins de milligrammes qu'indiqué sur l'étiquette. Si la mesure indique par exemple 4,9 mg pour une étiquette mentionnant 5 mg, le résultat correspond à 98 % de la valeur déclarée.

Le ratio d'excipients explique pourquoi une poudre peut peser davantage que la quantité nette de peptide. Pour calculer la concentration d'une solution mère, le calcul s'effectue à partir de la teneur mesurée en peptide et non à partir du poids total de la poudre. Le guide de reconstitution détaille la procédure de mise en solution d'un lyophilisat.

Ce qu'indique un chromatogramme HPLC

Un chromatogramme est une courbe avec le temps sur l'axe horizontal et l'intensité du signal sur l'axe vertical. Chaque composé élué de la colonne produit un pic. Le moment auquel apparaît le sommet d'un pic est appelé temps de rétention. Le composé recherché correspond généralement au pic principal le plus important, et la pureté représente l'aire sous ce pic divisée par l'aire totale de l'ensemble des pics détectés. Une revue de Mant et collaborateurs (2007) décrit la HPLC en phase inverse comme la méthode de référence pour l'analyse des peptides synthétiques.

La présence de pics secondaires mineurs est habituelle. Le profil optimal présente un pic principal étroit et symétrique, accompagné de traces négligeables. Un pic principal large, dédoublé ou présentant un épaulement signale un mélange que la colonne ne sépare pas correctement. Les pics secondaires immédiatement adjacents au pic principal correspondent fréquemment à des peptides apparentés : des variantes auxquelles il manque un acide aminé, des chaînes latérales oxydées ou d'autres formes de dégradation. L'article de synthèse de D'Hondt et collaborateurs (2014) détaille de manière systématique ces types d'impuretés apparentées. Pour comprendre l'origine de ces variantes lors de la synthèse, consultez Qu'est-ce que les peptides.

Vérifier l'authenticité du rapport

BTLabs dispose d'une page de vérification dédiée (verify.btlabtesting.com) sur laquelle vous saisissez le Report # afin d'obtenir le rapport directement auprès du laboratoire, sans intermédiaire. L'intérêt d'une analyse par un tiers indépendant disparaît si l'on doit se fier à la seule parole du fournisseur quant à l'existence réelle de cet organisme.

Procédure pratique :

1. Relevez le numéro de lot sur l'étiquette du vial.
2. Recherchez le rapport correspondant par numéro de lot sur Rapports de laboratoire.
3. Relevez le Report # et vérifiez-le sur la page de vérification de BTLabs, ou cliquez sur le lien de vérification associé au rapport.
4. Comparez le nom de la substance, le contenu mentionné sur l'étiquette et le numéro de lot entre le rapport, la vérification et le vial.

La nécessité de cette démarche est confirmée par la littérature scientifique. Verbeke et collaborateurs (2015) ont analysé des peptides synthétiques commercialisés avec une pureté revendiquée d'au moins 95 %. Moins de la moitié atteignait cette pureté lors de leurs propres analyses, et dans un échantillon, le constituant majoritaire présentait une structure différente de celle du peptide attendu. Leur conclusion rappelait que les chercheurs ne doivent pas accorder une confiance aveugle au certificat fourni par le distributeur.

Ce qu'un rapport ne mentionne pas

Un rapport de lot concerne exclusivement le contenu d'un vial. Il ne fournit aucune indication sur l'activité biologique de la substance ni sur une quelconque utilisation. Il s'agit d'un certificat d'analyse, et non d'une notice technique ou d'une recommandation d'usage. BTLabs le précise expressément : le rapport ne fournit aucune donnée relative aux particules, à la contamination microbienne ou aux endotoxines, et les résultats s'appliquent uniquement à l'échantillon testé tel qu'il a été réceptionné.

Le document décrit la poudre sèche au moment exact de l'analyse. La stabilité du peptide après ouverture ou remise en solution n'entre pas dans le cadre de ce document ; ce point est traité dans Conserver les peptides.

De même, les contre-ions ne sont généralement pas pris en compte. Les peptides synthétiques sont couramment livrés sous forme de sels après purification, par exemple sous forme de trifluoroacétate (TFA). La pureté HPLC quantifie les pics peptidiques, sans mesurer ce sel. Cette présence peut avoir un impact pour la recherche cellulaire : Cornish et collaborateurs (1999) ont observé que le TFA à de faibles concentrations inhibait la prolifération des ostéoblastes et des chondrocytes en culture cellulaire.

Foire aux questions

Pourquoi plusieurs numéros figurent-ils sur le rapport ?

Le Report # sert à la vérification directe auprès du laboratoire. Le Lot Number identifie le lot de fabrication et doit concorder avec l'étiquette de votre vial. Le BT Sample ID correspond à la référence interne de l'échantillon attribuée par le laboratoire.

Une pureté de 98 % est-elle suffisante ?

Cela dépend des exigences du protocole de recherche. Le rapport indique la spécification requise et la valeur mesurée. Le pourcentage résiduel est généralement composé de peptides apparentés dont l'identité exacte n'est pas spécifiée sur le rapport ; ces impuretés peuvent avoir une incidence sur des modèles cellulaires sensibles.

Quelle est la différence entre pureté et teneur ?

La pureté représente la proportion du peptide cible au sein de la fraction peptidique totale. La teneur représente la quantité absolue de peptide en milligrammes présente dans le vial, comparée à la valeur déclarée sur l'étiquette.

Le rapport renseigne-t-il sur la stérilité ?

Non. La stérilité, les endotoxines et les particules ne sont pas mesurées, sauf si ces analyses spécifiques ont été expressément requises et mentionnées sur le rapport.

Références

1. Verbeke F, Wynendaele E, Braet S, D'Hondt M, De Spiegeleer B. Quality evaluation of synthetic quorum sensing peptides used in R&D. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29403929/
2. D'Hondt M, et al. Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25044089/
3. Mant CT, et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods in Molecular Biology, 2007. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18604941/
4. Cornish J, et al. Trifluoroacetate, a contaminant in purified proteins, inhibits proliferation of osteoblasts and chondrocytes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism, 1999. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10567002/