Pureté, HPLC et spectrométrie de masse : deux mesures, deux questions

Chaque fournisseur affiche un indice de pureté sur sa page. Le chiffre seul ne suffit pas : la question est de savoir quelle mesure le sous-tend et ce que cette mesure permet d'établir. Deux analyses répondent à deux questions distinctes, et les deux sont nécessaires. Ci-dessous : comment lire un chromatogramme et un spectre de masse, et quelles sont les limites d'un rapport.

Ce qu'exprime réellement un pourcentage

La pureté est déterminée par HPLC. L'échantillon passe sous pression à travers une colonne qui sépare les composants selon leur affinité avec le matériau de la colonne. Pour les peptides, il s'agit presque systématiquement d'une HPLC en phase inverse : une colonne apolaire et une phase mobile dont la proportion de solvant organique augmente progressivement. Ce qui sort en premier de la colonne présente une liaison faible ; ce qui sort plus tard se lie plus fortement. Un détecteur UV situé à l'extrémité enregistre les fractions éluées, généralement à une longueur d'onde où la liaison peptidique absorbe. La revue de Mant et ses collègues (2007) décrit ce dispositif comme le standard pour l'analyse et la purification des peptides synthétiques.

Le résultat est un chromatogramme comportant des pics. La pureté correspond à l'aire du pic principal divisée par l'aire totale des pics. Si la valeur indiquée est de 99,4 %, cela signifie que parmi tout ce que le détecteur a enregistré, 99,4 % correspondait à une seule substance. Notez ce que cette définition ne précise pas : l'identité de cette substance.

Lire un chromatogramme

L'axe horizontal indique le temps en minutes, l'axe vertical l'intensité du signal du détecteur. Trois éléments méritent une attention particulière.

Temps de rétention. Le moment où le sommet d'un pic apparaît. Dans des conditions identiques (colonne, phase mobile, gradient, température), la même substance élue toujours approximativement au même moment. En cas de comparaison avec un étalon de référence, un temps de rétention identique constitue une indication d'identité, mais pas une preuve : deux peptides distincts peuvent sortir de la colonne de manière quasi simultanée.

Aire du pic. La pureté est calculée à partir de l'aire sous les pics, et non de leur hauteur. Un pic étroit et haut ainsi qu'un pic large et bas peuvent présenter la même aire. Le logiciel trace une ligne de base et intègre chaque pic supérieur à un seuil défini ; l'emplacement de cette ligne de base et la prise en compte des petits pics influencent la dernière décimale du résultat.

Forme du pic. Un pic principal conforme est étroit et symétrique. Un épaulement, une traînée ou un double sommet indique qu'un composant co-élue sous le pic principal. C'est la limite inhérente à tout pourcentage HPLC : une impureté qui élue exactement en même temps que le peptide est comptabilisée dans le pic principal. La valeur de pureté dépend donc directement de la qualité de la séparation.

Les petits pics situés juste avant ou après le pic principal correspondent souvent à des peptides apparentés. L'article de revue de D'Hondt et ses collègues (2014) répertorie les types connus, notamment les variantes avec un acide aminé manquant ou supplémentaire, l'oxydation, la désamidation et les isomères optiques d'acides aminés. Pour comprendre comment les peptides sont assemblés et pourquoi ces variantes apparaissent, consultez Que sont les peptides.

Pourquoi l'identité nécessite une mesure dédiée

La spectrométrie de masse ionise la molécule et mesure le rapport masse/charge. Cela produit une valeur qui peut être comparée à la masse théorique du composé attendu.

Pour BPC-157, cette masse attendue est de 1419,5 g/mol ; pour le fragment de TB-500 Ac-LKKTETQ, elle est de 889,0 g/mol. Si la masse mesurée correspond à la masse attendue, cela constitue une forte indication qu'il s'agit de la substance visée. Si elle diffère, il s'agit d'un composé différent, quel que soit son niveau de pureté.

Tous les laboratoires ne confirment pas l'identité par spectrométrie de masse. Certains rapports, dont les rapports actuels de BTLabs, utilisent la FTIR, une spectroscopie infrarouge où le spectre de l'échantillon doit présenter les bandes caractéristiques du peptide. La lecture détaillée d'un tel document est expliquée dans Comment lire un rapport de lot BTLabs.

Lire un spectre de masse

L'axe horizontal d'un spectre de masse indique le m/z, la masse divisée par la charge ; l'axe vertical indique l'intensité relative. Avec l'ionisation par électrospray, la technique usuelle pour les peptides, une molécule capte un ou plusieurs protons. Par conséquent, le même peptide apparaît souvent à plusieurs endroits.

Prenons BPC-157. La masse monoisotopique, calculée à partir de la séquence, est d'environ 1418,7. Avec un proton supplémentaire, l'ion [M+H]+ est attendu autour de m/z 1419,7 ; avec deux protons, [M+2H]2+ est attendu autour de m/z 710,4, la masse étant divisée par deux. Les deux signaux renvoient à la même molécule.

Notez également la différence entre masse moyenne et masse monoisotopique. La masse moyenne (1419,5 g/mol) prend en compte la distribution isotopique naturelle ; la masse monoisotopique ne prend en compte que les isotopes les plus légers. Un rapport doit mentionner laquelle des deux est utilisée. L'écart toléré entre la masse mesurée et la masse attendue dépend de l'instrument : quelques dixièmes d'unité de masse pour un instrument standard, quelques ppm en haute résolution.

Une anomalie peut souvent être identifiée. Une différence d'environ +16 correspond à une oxydation, environ +1 à une désamidation et −18 à une perte d'eau. Un déficit correspondant à la masse d'un acide aminé, comme −57 pour la glycine ou −97 pour la proline, indique une variante par délétion.

Adduits et signaux de fond

Tout signal supplémentaire sur un spectre ne constitue pas une impureté dans l'échantillon. Lors de l'ionisation, d'autres ions se fixent facilement au peptide, formant ce que l'on appelle des adduits. Les plus fréquents sont le sodium, à environ +22 par rapport à [M+H]+, le potassium à environ +38 et l'ammonium à environ +17. Pour BPC-157, un adduit de sodium est donc attendu autour de m/z 1441,7.

La synthèse de Keller et ses collègues (2008) récapitule ces signaux parasites et ions de fond en spectrométrie de masse, depuis les adduits jusqu'aux plastifiants et résidus de solvants. Règle empirique : si un signal supplémentaire se situe à une différence de masse fixe et connue par rapport à l'ion principal, il s'agit vraisemblablement d'un adduit de la même molécule et non d'une seconde substance.

Impact d'une impureté sur vos mesures

En recherche, ce point n'est pas purement théorique. Un échantillon d'une pureté de 90 % considéré à tort comme étant à 99 % introduit un écart de 10 % sur la concentration calculée. Cela décale une courbe concentration-réponse sans explication apparente.

Plus problématique encore : une impureté qui présente une activité propre dans votre modèle. La réponse mesurée résulte alors de deux substances tout en étant attribuée à une seule. Il ne s'agit plus d'une mesure entachée de bruit, mais de la mesure d'un autre phénomène. Verbeke et ses collègues (2015) ont démontré la réalité de ce problème dans la pratique : parmi les peptides synthétiques vendus avec une pureté minimale annoncée de 95 %, moins de la moitié atteignait cette valeur lors de leurs propres analyses.

La dégradation après réception intervient également. L'oxydation et la désamidation se produisent non seulement lors de la synthèse, mais aussi au cours du stockage, en particulier en solution ; voir Conservation des peptides.

Ce que nous publions, et ce que cela n'est pas

Pour les lots disposant d'un rapport, nous publions le rapport complet de BTLabs avec le numéro de lot, permettant d'associer directement la vial au document. Le numéro de rapport et le lien de vérification permettent de contrôler le rapport directement auprès du laboratoire. Si un produit ne dispose pas encore de rapport, la mention « Rapport de lot à venir » est indiquée. Tous les rapports sont disponibles sur Lab reports.

Un rapport constitue une donnée vérifiable, et non une promesse. Il indique le contenu de la vial testée au moment de l'analyse. La stérilité, les endotoxines et les contre-ions en sont exclus, sauf s'ils ont été mesurés séparément. Il ne fournit aucune indication sur l'activité de la substance et ne constitue pas un conseil d'utilisation ; la littérature scientifique est disponible à cet effet, référencée sur chaque page produit avec son PMID.

Foire aux questions

Une pureté élevée suffit-elle à confirmer l'identité ?

Non. La pureté HPLC indique quelle proportion de l'échantillon correspond à une substance unique, mais pas de quelle substance il s'agit. Une mesure d'identité distincte est nécessaire pour cela, comme la spectrométrie de masse ou la FTIR.

Pourquoi le même peptide apparaît-il à plusieurs endroits du spectre de masse ?

Un peptide peut capter un ou plusieurs protons et se lier à des ions tels que le sodium ou le potassium. Chacune de ces formes produit son propre signal. Si ces signaux présentent un écart de masse connu entre eux, ils correspondent à la même molécule.

Quel écart est toléré entre la masse mesurée et la masse attendue ?

Cela dépend de l'instrument et du type de masse utilisé dans le rapport (masse moyenne ou monoisotopique). Pour les instruments standards, un écart de quelques dixièmes est habituel, contre quelques ppm en haute résolution. Des écarts plus importants correspondant à une différence fixe, comme +16 ou −18, indiquent une variante apparentée.

Que signifie le temps de rétention ?

Il s'agit du moment auquel une substance est éluée de la colonne. Dans des conditions identiques, ce temps est reproductible, ce qui facilite la comparaison avec une référence. À lui seul, le temps de rétention ne prouve pas l'identité.

Sources

1. Mant CT, et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods in Molecular Biology, 2007. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18604941/
2. D'Hondt M, et al. Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25044089/
3. Keller BO, Sui J, Young AB, Whittal RM. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 2008. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18790129/
4. Verbeke F, Wynendaele E, Braet S, D'Hondt M, De Spiegeleer B. Quality evaluation of synthetic quorum sensing peptides used in R&D. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29403929/