Wat zijn peptiden? Een inleiding voor onderzoekers

Peptiden zitten overal in de biologie: als signaalstoffen tussen cellen, als bouwstenen van eiwitten en als fragmenten die ontstaan wanneer eiwitten worden afgebroken. In het laboratorium zijn synthetische peptiden een belangrijk gereedschap om mechanismen en signaalroutes in celmodellen en diermodellen te bestuderen. Deze inleiding legt uit wat een peptide is, hoe het wordt gemaakt en gecontroleerd, welke onderzoeksgroepen je in onze catalogus vindt en waar je op let bij het kiezen van een leverancier.

Wat is een peptide?

Een peptide is een keten van aminozuren die met peptidebindingen aan elkaar zijn gekoppeld. Elk aminozuur heeft een aminogroep, een carboxylgroep en een zijketen die het aminozuur zijn eigen karakter geeft: geladen of neutraal, waterminnend of waterafstotend, klein of omvangrijk. Er zijn twintig standaardaminozuren die in eiwitten voorkomen, en de volgorde waarin ze in een keten staan, de sequentie, bepaalt de eigenschappen van het peptide.

Een keten heeft altijd twee uiteinden: het N-terminale uiteinde met een vrije aminogroep en het C-terminale uiteinde met een vrije carboxylgroep. Sequenties worden van N naar C geschreven, in drielettercode (Ala-Glu-Asp-Gly) of eenlettercode (AEDG). Veel onderzoekspeptiden zijn bovendien gemodificeerd, bijvoorbeeld met een geamideerd C-terminaal uiteinde, een geacetyleerd N-terminaal uiteinde, een ringstructuur of een gebonden metaalion, zoals bij het koperpeptide GHK-Cu.

De verbinding tussen twee aminozuren, de peptidebinding, is een amidebinding tussen de carboxylgroep van het ene aminozuur en de aminogroep van het volgende. Bij het vormen van die binding komt een watermolecuul vrij; het is een condensatiereactie. De binding is vlak en vrij star, waardoor een peptideketen zich niet willekeurig kan vouwen. De zijketens bepalen vervolgens of een keten een helix vormt, een uitgestrekte structuur aanneemt of in oplossing grotendeels flexibel blijft.

Omgekeerd kan water de peptidebinding ook weer verbreken (hydrolyse). Dat gebeurt langzaam, maar het is een van de redenen dat peptiden in oplossing minder lang stabiel zijn dan als droog poeder. Goede bewaring is daarom net zo belangrijk als een zuivere synthese.

Peptide of eiwit?

Het verschil tussen een peptide en een eiwit is vooral een kwestie van lengte en structuur, en de grens is niet scherp. In de praktijk spreekt men bij korte ketens, grofweg tot vijftig aminozuren, van peptiden. Langere ketens die zich tot een stabiele driedimensionale structuur vouwen, heten eiwitten. Daarbinnen bestaan aanduidingen als dipeptide (twee aminozuren), tripeptide (drie), tetrapeptide (vier) en oligopeptide (enkele tot tientallen).

Een voorbeeld: Epithalon is een tetrapeptide van vier aminozuren, terwijl thymosine bèta-4 een klein eiwit is waarvan in onderzoek vaak een synthetisch fragment wordt gebruikt. Dat onderscheid tussen eiwit en fragment is een goed voorbeeld van waarom je bij elk onderzoekspeptide de exacte identiteit moet kennen.

Peptiden zijn ook in de farmaceutische wereld een belangrijke stofklasse. Muttenthaler en collega's (2021) beschrijven in Nature Reviews Drug Discovery dat sinds de introductie van insuline meer dan tachtig op peptiden gebaseerde producten een markttoelating hebben gekregen. Dat zijn geregistreerde producten met een eigen ontwikkel- en toelatingstraject; onderzoekspeptiden horen daar niet bij.

Hoe worden peptiden gemaakt?

Vrijwel alle synthetische onderzoekspeptiden worden gemaakt met vastefasepeptidesynthese, in het Engels solid-phase peptide synthesis (SPPS). Die methode werd ontwikkeld door Bruce Merrifield, die er in 1984 de Nobelprijs voor Scheikunde voor kreeg; zijn overzicht verscheen in 1986 in Science.

Het principe: het eerste aminozuur wordt met zijn C-terminale uiteinde verankerd aan een onoplosbare kunstharsdrager. Daarna wordt de keten stap voor stap verlengd. Elke stap bestaat uit het verwijderen van een beschermgroep, het koppelen van het volgende aminozuur en uitgebreid wassen, zodat overtollige reagentia wegspoelen terwijl de groeiende keten aan de drager vast blijft zitten. Tegenwoordig wordt meestal Fmoc-chemie gebruikt. Behrendt en collega's (2016) beschrijven in het Journal of Peptide Science hoe die techniek is verbeterd, met aandacht voor beschermgroepen, het voorkomen van racemisatie en het inbouwen van modificaties.

Na de laatste stap wordt het peptide van de drager afgesplitst, meestal met trifluorazijnzuur (TFA), en van de zijketenbeschermgroepen ontdaan. Het ruwe product wordt gezuiverd met preparatieve HPLC en vervolgens gevriesdroogd tot een poeder, het lyofilisaat.

Zuiverheid en analyse

Geen synthese is perfect. Bij elke koppelingsstap kan een klein deel van de ketens achterblijven, en dat telt bij langere peptiden op. Een review van D'Hondt en collega's (2014) in het Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis zet de typische verwante onzuiverheden op een rij: ketens waarin een aminozuur ontbreekt (deletie) of dubbel is ingebouwd (insertie), varianten met een gespiegeld aminozuur door racemisatie, geoxideerde zijketens en restanten van tegenionen zoals trifluoracetaat.

Twee analyses vormen daarom de basis van elk betrouwbaar analyserapport:

• HPLC scheidt het hoofdpeptide van verwante onzuiverheden en drukt de zuiverheid uit als percentage van het totale signaal.
• Een identiteitstest bevestigt dat het juiste molecuul in de vial zit. Massaspectrometrie doet dat door de gemeten massa te vergelijken met de verwachte massa van de sequentie; FTIR (infraroodspectroscopie) door het spectrum te vergelijken met een referentie.

De twee meten iets anders en vullen elkaar aan: een hoge HPLC-zuiverheid zegt niets als het hoofdpeptide het verkeerde molecuul is, en een kloppende massa zegt weinig als er veel bijproducten zijn. Hoe je beide leest, staat uitgebreid in ons artikel over zuiverheid, HPLC en massaspectrometrie.

Onderzoeksgroepen in onze catalogus

De peptiden in de catalogus van PEPTID8 zijn ingedeeld naar het onderzoeksterrein waarin ze in de literatuur het vaakst voorkomen. Die indeling zegt iets over de onderzoeksvraag, niet over een toepassing.

• Herstelonderzoek: peptiden zoals BPC-157 en TB-500, die in preklinisch onderzoek worden bestudeerd in modellen voor weefselherstel en wondgenezing in celmodellen.
• Levensduuronderzoek: onder meer MOTS-c, een peptide dat in mitochondriaal DNA is gecodeerd, en Epithalon, bekend uit telomeeronderzoek. Hier draait het om celveroudering, metabole signaalroutes en mitochondriale functie in cel- en diermodellen.
• Groeifactoronderzoek: peptiden zoals Ipamorelin en CJC-1295, die worden gebruikt om de groeihormoon-as in preklinisch onderzoek te bestuderen.
• Cognitief onderzoek: Semax en Selank, synthetische peptiden uit Russisch onderzoek die in diermodellen worden bestudeerd op neurologische en gedragsmatige uitkomstmaten.
• Huid & pigmentatie: onder meer GHK-Cu en KPV, bestudeerd in huidcelmodellen, onder andere op collageensynthese en signaalroutes van het immuunsysteem.

RUO en regelgeving

Alle peptiden bij PEPTID8 zijn uitsluitend bestemd voor laboratoriumonderzoek: research use only, afgekort RUO. Dat is geen formaliteit. Een onderzoekspeptide is geen geneesmiddel: het heeft geen markttoelating van het CBG of de EMA, en de gegevens die voor zo'n toelating nodig zijn, ontbreken. Daarom horen bij onderzoekspeptiden geen gebruiksaanwijzingen, geen doseringsadvies en geen claims over uitkomsten bij mensen.

Voor onderzoekers betekent het RUO-kader ook dat de verantwoordelijkheid voor een goede onderzoeksopzet, de juiste vergunningen en een zorgvuldige registratie bij het laboratorium ligt. Klinische studies met peptiden bestaan wel, maar die worden uitgevoerd met geregistreerd studiemateriaal onder toezicht van een ethische commissie, niet met producten uit een RUO-catalogus.

Een betrouwbare leverancier herkennen

De kwaliteit van onderzoekspeptiden loopt sterk uiteen. Verbeke en collega's (2015) lieten dat zien in het Journal of Pharmaceutical Analysis: zij analyseerden een reeks synthetische peptiden die voor onderzoek waren gekocht met een opgegeven zuiverheid van ten minste 95 procent. Slechts 44 procent voldeed aan die specificatie, en in één monster bleek de hoofdcomponent een ander molecuul te zijn dan besteld. De meeste onzuiverheden waren deletievarianten.

Een paar punten om op te letten:

• Een analyserapport per lot, niet één algemeen certificaat voor alle partijen.
• Een onafhankelijk laboratorium dat de analyse uitvoert, met een verify-link of code om het rapport te controleren.
• Zowel HPLC als een identiteitstest (massaspectrometrie of FTIR), met het chromatogram en het spectrum zichtbaar.
• Een consistent RUO-kader, zonder gebruiksclaims, gebruiksschema's of advies over hoeveelheden.
• Duidelijke bedrijfsgegevens en een aanspreekpunt voor vragen over analyse en bewaring.

Een uitgebreidere checklist vind je in ons artikel betrouwbaar peptides kopen: de controlelijst.

Het labrapport bij PEPTID8

Bij elk product staat, als het beschikbaar is, het analyserapport van BTLabs. Het rapport bevat een HPLC-bepaling van de zuiverheid en een FTIR-spectrum dat de identiteit bevestigt, en het hoort bij een specifiek lotnummer. Via de verify-link controleer je of het document echt bij dat lot hoort; alle rapporten staan ook op de pagina certificaten. Het rapport beschrijft wat er in de vial zit. Het is geen gebruiksadvies en zegt niets over toepassing buiten het laboratorium.

Veelgestelde vragen

Wat is het verschil tussen een peptide en een eiwit?

Vooral de lengte en de structuur. Korte ketens, grofweg tot vijftig aminozuren, heten meestal peptiden; langere ketens die zich tot een stabiele driedimensionale vorm vouwen, heten eiwitten. De grens is niet scherp.

Hoe wordt een synthetisch peptide gemaakt?

Meestal met vastefasepeptidesynthese: de keten wordt aminozuur voor aminozuur opgebouwd op een vaste drager, daarna afgesplitst, gezuiverd met HPLC en gevriesdroogd. Fmoc-chemie is daarbij de standaard.

Wat betekent 98 procent zuiverheid?

Dat in de HPLC-meting 98 procent van het signaal bij het hoofdpeptide hoort en 2 procent bij verwante onzuiverheden. Het getal zegt niets over de identiteit; daarvoor is een aparte identiteitstest nodig, zoals FTIR of massaspectrometrie.

Waarom staat er geen gebruiksinformatie bij de producten?

Omdat het onderzoekspeptiden zijn, uitsluitend voor laboratoriumonderzoek. Ze zijn geen geneesmiddel, niet voor gebruik bij mensen, en er hoort geen doseringsadvies bij.

Bronnen

1. Muttenthaler M, King GF, Adams DJ, Alewood PF. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery, 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33536635/
2. Merrifield B. Solid phase synthesis. Science, 1986. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/3961484/
3. Behrendt R, White P, Offer J. Advances in Fmoc solid-phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science, 2016. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26785684/
4. D'Hondt M, Bracke N, Taevernier L, Gevaert B, Verbeke F, Wynendaele E, De Spiegeleer B. Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25044089/
5. Verbeke F, Wynendaele E, Braet S, D'Hondt M, De Spiegeleer B. Quality evaluation of synthetic quorum sensing peptides used in R&D. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29403929/