Peptiden bewaren: lyofilisaat, oplossing en houdbaarheid in het lab

Een peptide dat bij aankomst een hoge zuiverheid heeft, kan na een paar weken in een slecht bewaarde oplossing een ander product zijn geworden. Peptiden zijn ketens van aminozuren, en die ketens zijn gevoelig voor water, zuurstof, licht en temperatuurschommelingen. Dit artikel beschrijft de gangbare laboratoriumpraktijk voor het bewaren van gelyofiliseerde en opgeloste peptiden, en legt uit waarom die praktijk is zoals ze is.

Gelyofiliseerd poeder: de stabielste vorm

De meeste onderzoekspeptiden worden geleverd als lyofilisaat: een droog poeder of compacte 'cake' die ontstaat door de oplossing in te vriezen en het water onder vacuüm te laten sublimeren. Een review van Butreddy en collega's (2021) in de International Journal of Biological Macromolecules beschrijft waarom die vaste vorm de voorkeur heeft: in de droge toestand nemen zowel fysische als chemische afbraak sterk af vergeleken met vloeibare formuleringen. Reacties waarvoor water nodig is, zoals hydrolyse van de peptideketen en deamidering van asparagine en glutamine, verlopen nauwelijks zonder water. Dezelfde review wijst er ook op dat het vriesdroogproces zelf stress geeft; bevriezen en drogen kunnen aggregatie veroorzaken, en daarom optimaliseren producenten dat proces zorgvuldig.

Voor het lab betekent dit:

• Lange termijn: gangbare laboratoriumpraktijk is bewaren bij −20 °C of kouder, in een goed gesloten vial.
• Korte termijn: in de koelkast bij 2–8 °C.
• Transport: korte periodes bij kamertemperatuur, zoals tijdens verzending, worden door de meeste lyofilisaten in de praktijk goed verdragen. Een bewaarplek is kamertemperatuur niet.
• Donker: bewaar vials in hun doos of een afgesloten bak, niet op een vensterbank of onder een lamp.

Vocht: de onderschatte factor

Een lyofilisaat is hygroscopisch: het trekt water aan uit de lucht. Het grootste risico ontstaat op het moment dat een koude vial wordt geopend. Er slaat dan direct condens neer op het poeder, en dat water blijft na het sluiten in de vial achter.

Gangbare werkwijze is daarom om de gesloten vial eerst op kamertemperatuur te laten komen, bij voorkeur in een exsiccator of een afgesloten bakje met droogmiddel. Werk daarna snel en sluit de vial direct weer af. Sommige labs vullen de kopruimte van een geopende vial met een droog, inert gas zoals stikstof of argon. Een poeder dat ingezakt, glazig of kleverig oogt, heeft vaak vocht opgenomen; dat is reden om de zuiverheid opnieuw te laten bepalen voordat je ermee verder gaat.

Opgeloste peptiden: kortere houdbaarheid

Zodra een peptide is opgelost, versnellen de chemische en fysische afbraakroutes. Manning en collega's (2010) geven in Pharmaceutical Research een overzicht van die routes en van de manieren om eiwitten en peptiden zowel in waterige oplossing als in gedroogde toestand te stabiliseren. Een review van Zapadka en collega's (2017) in Interface Focus richt zich specifiek op aggregatie van peptiden: het samenklonteren tot amorfe aggregaten of geordende fibrillen. Volgens die review hangt aggregatie af van onder meer sequentie, concentratie, pH, lading, contact met oppervlakken, onzuiverheden, temperatuur, schudden en lyofilisatie.

Er bestaat daarom geen universele houdbaarheid voor een opgeloste peptide. Gangbare laboratoriumpraktijk is:

• opgeloste peptiden voor korte termijn bewaren bij 2–8 °C;
• voor langere termijn verdelen in porties en invriezen bij −20 °C of −80 °C;
• niet heftig schudden bij het oplossen, maar zacht zwenken of rollen;
• de oplossing helder houden: troebelheid of deeltjes wijzen op aggregatie of slechte oplosbaarheid.

Als oplosmiddel wordt vaak bacteriostatisch water gebruikt: steriel water met een kleine hoeveelheid benzylalcohol als conserveermiddel, dat bacteriegroei remt wanneer dezelfde vial vaker wordt geopend. Meer over de samenstelling en de verschillen met steriel water lees je in ons artikel over bacteriostatisch water. De stappen voor het oplossen zelf staan in de reconstitutiegids. Hydrofobe peptiden lossen soms slecht op in water en vragen om een andere aanpak; controleer daarvoor de productinformatie.

Herhaald invriezen en ontdooien vermijden

Invriezen lijkt de zekerste keuze, maar elk moment van invriezen en ontdooien belast de peptide. Bij het bevriezen ontstaan ijskristallen; peptide en opgeloste zouten concentreren zich in de resterende vloeistof, en aan het grensvlak tussen ijs en water kunnen moleculen ontvouwen of samenklonteren. In sommige buffers verschuift bovendien de pH tijdens het bevriezen.

Hoe groot die invloed kan zijn, laat een studie van Kueltzo en collega's (2008) in het Journal of Pharmaceutical Sciences zien. Bij herhaald invriezen en ontdooien van een monoklonaal antilichaam ontstonden aggregaten, meer naarmate de pH lager was. Ook het containermateriaal maakte groot verschil: in Teflon en in bepaalde commerciële vriescontainers ontstond aanzienlijk meer aggregatie dan in plastic of glas. Een antilichaam is een groot eiwit, maar het onderliggende principe, stress door concentratie en grensvlakken, geldt ook voor peptiden.

Aliquoteren: één keer ontdooien per portie

De praktische oplossing is aliquoteren: de oplossing direct na het oplossen verdelen in kleine porties, elk afgestemd op één experiment. Zo wordt elke portie maar één keer ontdooid en blijft de rest onaangeroerd in de vriezer.

• Gebruik schone, goed sluitende buisjes of vials van glas of polypropyleen; peptiden kunnen aan sommige oppervlakken hechten.
• Houd de kopruimte klein om het contact met zuurstof te beperken.
• Vries de porties snel in en bewaar ze op een vaste plek in de vriezer, niet in de deur.
• Ontdooi een portie op ijs of in de koelkast en gebruik wat over is niet opnieuw na hervriezen.

Oxidatiegevoelige residuen: Met, Cys en Trp

Niet elk peptide is even kwetsbaar. Sequenties met methionine (Met), cysteïne (Cys) of tryptofaan (Trp) zijn extra gevoelig voor oxidatie. Methionine oxideert tot methioninesulfoxide, cysteïne kan ongewenste disulfidebruggen vormen, en tryptofaan levert diverse oxidatieproducten op en is daarnaast lichtgevoelig.

Ji en collega's (2009) onderzochten dit in het Journal of Pharmaceutical Sciences met een modeleiwit. Zij identificeerden en kwantificeerden de oxidatie van methionine, tryptofaan en histidine onder verschillende oxiderende omstandigheden. Vrij methionine in de oplossing beschermde tegen oxidatie door waterstofperoxide, en een combinatie van tryptofaan en methionine bood bescherming tegen meerdere soorten oxidatie.

Voor peptiden met deze residuen is de gangbare praktijk: zuurstof beperken (inert gas, kleine kopruimte, eventueel ontgast oplosmiddel), donker bewaren in amberkleurige vials of in aluminiumfolie, en koud bewaren. In een massaspectrometrische analyse is oxidatie vaak herkenbaar als een extra signaal dat 16 dalton zwaarder is dan de verwachte massa, één extra zuurstofatoom.

Etiketteren en registreren

Goede bewaring valt of staat met goede administratie. Een vial of buisje zonder etiket is in een gedeelde vriezer na een paar weken waardeloos. Zet op elk etiket minimaal:

• naam van het peptide en het lotnummer;
• concentratie en oplosmiddel;
• datum van oplossen en initialen;
• bewaartemperatuur.

Gebruik vriesbestendige etiketten of een watervaste marker en houd daarnaast een logboek bij waarin je per lot noteert wanneer het is opgelost, in hoeveel porties en waar die staan. Koppel dat logboek aan het lotnummer op het analyserapport, zodat je altijd kunt terugvinden bij welke zuiverheidsmeting een portie hoort.

Het labrapport en bewaring

Het analyserapport van BTLabs op de productpagina beschrijft het product op het moment van analyse. Het bevat een HPLC-bepaling van de zuiverheid en een FTIR-spectrum dat de identiteit bevestigt, gekoppeld aan een lotnummer dat je via de verify-link kunt controleren. Alle rapporten staan op de pagina certificaten. Of die zuiverheid behouden blijft, hangt daarna af van hoe het materiaal wordt bewaard. Het rapport is een analyse van identiteit en zuiverheid, geen gebruiksadvies. Los een lyofilisaat daarom bij voorkeur pas op wanneer het onderzoek erom vraagt; bacteriostatisch water vind je bij de lab-accessoires.

Veelgestelde vragen

Hoe lang blijft een gelyofiliseerd peptide goed?

Dat verschilt per sequentie, maar droog, donker en bij −20 °C of kouder is een lyofilisaat in de regel aanzienlijk langer stabiel dan een opgeloste peptide. Vocht is de grootste vijand: laat een koude vial altijd eerst op kamertemperatuur komen voordat je hem opent.

Mag een opgeloste peptide terug in de vriezer?

Eén keer invriezen is gangbaar, herhaald invriezen en ontdooien niet. Verdeel de oplossing daarom direct in porties, zodat elke portie maar één keer wordt ontdooid.

Waarom bacteriostatisch water en niet gewoon steriel water?

Bacteriostatisch water bevat benzylalcohol, dat bacteriegroei remt wanneer dezelfde vial vaker wordt geopend. Steriel water zonder conserveermiddel is geschikt voor oplossingen die in één keer worden verwerkt. Sommige peptiden vragen om een ander oplosmiddel.

Hoe zie ik dat een peptide is afgebroken?

Troebelheid, deeltjes of een ingezakt, kleverig poeder zijn signalen, maar veel afbraak is met het oog niet te zien. Zekerheid geeft alleen een nieuwe analyse, bijvoorbeeld met HPLC en een identiteitstest.

Bronnen

1. Butreddy A, Janga KY, Ajjarapu S, Sarabu S, Dudhipala N. Instability of therapeutic proteins - An overview of stresses, stabilization mechanisms and analytical techniques involved in lyophilized proteins. International Journal of Biological Macromolecules, 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33275971/
2. Manning MC, Chou DK, Murphy BM, Payne RW, Katayama DS. Stability of protein pharmaceuticals: an update. Pharmaceutical Research, 2010. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20143256/
3. Zapadka KL, Becher FJ, Gomes Dos Santos AL, Jackson SE. Factors affecting the physical stability (aggregation) of peptide therapeutics. Interface Focus, 2017. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29147559/
4. Kueltzo LA, Wang W, Randolph TW, Carpenter JF. Effects of solution conditions, processing parameters, and container materials on aggregation of a monoclonal antibody during freeze-thawing. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17823949/
5. Ji JA, Zhang B, Cheng W, Wang YJ. Methionine, tryptophan, and histidine oxidation in a model protein, PTH: mechanisms and stabilization. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2009. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19455640/