Pureza, HPLC y espectrometría de masas: dos mediciones, dos preguntas

Elke leverancier zet een zuiverheidsgetal op de pagina. Het getal alleen is niet waar het om gaat: de vraag is welke meting eronder ligt en wat die meting kan vaststellen. Twee analyses beantwoorden twee verschillende vragen, en je hebt ze allebei nodig. Hieronder: hoe je een chromatogram en een massaspectrum leest, en waar de grenzen van een rapport liggen.

Wat een percentage eigenlijk uitdrukt

Zuiverheid wordt bepaald met HPLC. Het monster gaat onder druk door een kolom die de bestanddelen scheidt op hoe sterk ze aan het kolommateriaal binden. Bij peptiden is dat bijna altijd reversed-phase HPLC: een apolaire kolom en een loopvloeistof waarin het aandeel organisch oplosmiddel geleidelijk oploopt. Wat als eerste uit de kolom komt, bindt zwak; wat later komt, bindt sterker. Een UV-detector aan het eind registreert wat er langskomt, meestal bij een golflengte waarbij de peptidebinding absorbeert. Het overzicht van Mant en collega's (2007) beschrijft deze opzet als de standaard voor analyse en zuivering van synthetische peptiden.

Het resultaat is een chromatogram met pieken. De zuiverheid is het oppervlak van de hoofdpiek gedeeld door het totale piekoppervlak. Staat er 99,4 %, dan betekent dat: van alles wat de detector zag, was 99,4 % één stof. Let op wat er niet in die definitie staat: welke stof.

Een chromatogram lezen

Op de horizontale as staat de tijd in minuten, op de verticale de signaalsterkte van de detector. Drie dingen zijn de moeite van het bekijken waard.

Retentietijd. Het moment waarop de top van een piek verschijnt. Onder dezelfde omstandigheden (kolom, loopvloeistof, gradiënt, temperatuur) komt dezelfde stof steeds op ongeveer hetzelfde moment uit de kolom. Vergelijk je met een referentiestandaard, dan is een gelijke retentietijd een aanwijzing voor identiteit, maar geen bewijs: twee verschillende peptiden kunnen vrijwel tegelijk uit de kolom komen.

Piekoppervlak. De zuiverheid wordt berekend uit het oppervlak onder de pieken, niet uit de hoogte. Een smalle hoge piek en een brede lage piek kunnen hetzelfde oppervlak hebben. Software trekt een basislijn en integreert elke piek boven een ingestelde drempel; waar die basislijn ligt en welke kleine pieken worden meegeteld, beïnvloedt het getal in de laatste decimaal.

Piekvorm. Een goede hoofdpiek is smal en symmetrisch. Een schouder, een uitlopende staart of een dubbele top wijst erop dat er iets onder de hoofdpiek meekomt. Dat is het zwakke punt van elk HPLC-percentage: een verontreiniging die precies samen met het peptide uit de kolom komt, telt mee als hoofdpiek. Een zuiverheid is dus hooguit zo goed als de scheiding.

Kleine pieken vlak voor of na de hoofdpiek zijn vaak verwante peptiden. Het overzichtsartikel van D'Hondt en collega's (2014) zet de bekende soorten op een rij, waaronder varianten met een ontbrekend of extra aminozuur, oxidatie, deamidering en varianten met een gespiegelde aminozuurconfiguratie. Hoe peptiden worden opgebouwd en waarom zulke varianten ontstaan, lees je in Wat zijn peptiden.

Waarom identiteit een eigen meting nodig heeft

Massaspectrometrie ioniseert het molecuul en meet de verhouding tussen massa en lading. Daar komt een getal uit dat je kunt vergelijken met de theoretische massa van de verbinding die je verwacht.

Voor BPC-157 is die verwachte massa 1419,5 g/mol; voor het TB-500-fragment Ac-LKKTETQ is het 889,0 g/mol. Klopt de gemeten massa met de verwachte, dan is dat een sterke aanwijzing dat het de bedoelde stof is. Wijkt hij af, dan heb je iets anders in handen, hoe zuiver het ook is.

Niet elk lab bevestigt identiteit met massaspectrometrie. Sommige rapporten, waaronder de huidige rapporten van BTLabs, gebruiken FTIR, een infraroodmeting waarbij het spectrum van het monster de karakteristieke banden van het peptide moet tonen. Hoe je zo'n rapport regel voor regel leest, staat in Zo lees je een BTLabs-batchrapport.

Een massaspectrum lezen

Op de horizontale as van een massaspectrum staat m/z, de massa gedeeld door de lading; op de verticale de relatieve intensiteit. Bij elektrospray-ionisatie, de gangbare techniek voor peptiden, neemt een molecuul één of meer protonen op. Daardoor zie je hetzelfde peptide vaak op meerdere plekken terug.

Neem BPC-157. De monoisotopische massa, berekend uit de sequentie, is ongeveer 1418,7. Met één extra proton verwacht je het ion [M+H]+ rond m/z 1419,7; met twee protonen [M+2H]2+ rond m/z 710,4, omdat de massa door twee wordt gedeeld. Beide signalen wijzen naar hetzelfde molecuul.

Let ook op het verschil tussen gemiddelde en monoisotopische massa. De gemiddelde massa (1419,5 g/mol) houdt rekening met de natuurlijke verdeling van isotopen; de monoisotopische massa rekent met alleen de lichtste isotopen. Een rapport hoort te vermelden welke van de twee bedoeld is. Hoe dicht gemeten en verwachte massa bij elkaar moeten liggen, hangt af van het instrument: bij een eenvoudig instrument enkele tienden van een massa-eenheid, bij hoge resolutie enkele ppm.

Een afwijking is vaak te herleiden. Een verschil van ongeveer +16 past bij oxidatie, ongeveer +1 bij deamidering en −18 bij verlies van water. Een tekort ter grootte van één aminozuur, zoals −57 voor glycine of −97 voor proline, wijst op een deletievariant.

Adducten en achtergrondsignalen

Niet elk extra signaal in een spectrum is een verontreiniging in het monster. Bij ionisatie hechten zich gemakkelijk andere ionen aan het peptide, zogeheten adducten. De bekendste zijn natrium, op ongeveer +22 ten opzichte van [M+H]+, kalium op ongeveer +38 en ammonium op ongeveer +17. Voor BPC-157 verwacht je een natriumadduct dus rond m/z 1441,7.

Het overzicht van Keller en collega's (2008) bundelt dit soort storende signalen en achtergrondionen in massaspectrometrie, van adducten tot weekmakers en oplosmiddelresten. De vuistregel: staat een extra signaal op een vast, bekend massaverschil van het hoofdion, dan is het waarschijnlijk een adduct van hetzelfde molecuul en geen tweede stof.

Wat een verontreiniging met je meting doet

In onderzoek is dit geen theoretisch punt. Een monster van 90 % zuiverheid waarvan je aanneemt dat het 99 % is, geeft een concentratie die 10 % naast je berekening ligt. Dat verschuift een concentratie-responscurve zonder dat je ziet waarom.

Lastiger is een verontreiniging die zelf actief is in je model. Dan meet je de respons op twee stoffen en schrijf je die toe aan één. Dat is geen meting met wat ruis, maar een meting van iets anders. Dat dit in de praktijk voorkomt, lieten Verbeke en collega's (2015) zien: van synthetische peptiden die als minimaal 95 % zuiver werden verkocht, haalde minder dan de helft die waarde bij hun eigen analyse.

Afbraak na ontvangst speelt ook mee. Oxidatie en deamidering ontstaan niet alleen bij de synthese maar ook bij bewaren, zeker in oplossing; zie Peptiden bewaren.

Wat wij publiceren, en wat dat niet is

Van de batches waarvan we een rapport hebben, publiceren we het volledige rapport van BTLabs, met het lotnummer, zodat je de vial in je hand terugvindt in het document. Via het rapportnummer en de verify-link controleer je het rapport rechtstreeks bij het lab. Heeft een product nog geen rapport, dan staat er "Batchrapport volgt". Alle rapporten vind je op Labrapporten.

Een rapport is een controleerbaar gegeven, geen belofte. Het zegt wat er in de geteste vial zat op het moment van meten. Steriliteit, endotoxinen en tegenionen vallen erbuiten, tenzij ze apart zijn gemeten. Het zegt niets over wat de stof doet en is geen gebruiksadvies; daarvoor is de literatuur er, en die staat op elke productpagina met een PMID erbij.

Veelgestelde vragen

Is een hoge zuiverheid genoeg om de identiteit vast te stellen?

Nee. HPLC-zuiverheid zegt welk deel van het monster één stof is, niet welke stof. Daarvoor is een aparte identiteitsmeting nodig, zoals massaspectrometrie of FTIR.

Waarom zie ik hetzelfde peptide op meerdere plekken in het massaspectrum?

Een peptide kan één of meer protonen opnemen en zich binden aan ionen zoals natrium of kalium. Elk van die vormen geeft een eigen signaal. Liggen die signalen op een bekend massaverschil van elkaar, dan gaat het om hetzelfde molecuul.

Hoeveel mag de gemeten massa afwijken van de verwachte?

Dat hangt af van het instrument en of het rapport gemiddelde of monoisotopische massa gebruikt. Bij eenvoudige instrumenten is een afwijking van enkele tienden gangbaar, bij hoge resolutie enkele ppm. Grotere afwijkingen op een vast verschil, zoals +16 of −18, wijzen op een verwante variant.

Wat betekent de retentietijd?

Het is het moment waarop een stof uit de kolom komt. Onder gelijke omstandigheden is die tijd reproduceerbaar, wat helpt bij vergelijking met een referentie. Op zichzelf bewijst een retentietijd geen identiteit.

Bronnen

1. Mant CT, et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods in Molecular Biology, 2007. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18604941/
2. D'Hondt M, et al. Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25044089/
3. Keller BO, Sui J, Young AB, Whittal RM. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 2008. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18790129/
4. Verbeke F, Wynendaele E, Braet S, D'Hondt M, De Spiegeleer B. Quality evaluation of synthetic quorum sensing peptides used in R&D. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29403929/