So lesen Sie einen BTLabs-Chargenbericht

Ein Chargenbericht ist das einzige Dokument, mit dem Sie überprüfen können, ob die Vial das enthält, was auf dem Etikett steht. Dennoch ist es meist eine PDF-Datei, die niemand öffnet, weil unklar ist, worauf man blickt. Nachfolgend wird erläutert, was die Bestandteile eines BTLabs-Berichts bedeuten, wie Sie den Bericht mit der Vial in Ihrer Hand abgleichen und wo die Grenzen des Dokuments liegen.

Zwei Messungen, zwei Fragestellungen

Ein Bericht von BTLabs enthält zwei Arten von Analysen, und es lohnt sich, diese auseinanderzuhalten. HPLC, Flüssigkeitschromatographie, trennt die Probe in ihre Bestandteile auf und misst die relative Größe jedes Anteils. Dies liefert den Reinheitswert: welcher Prozentsatz des Inhalts der Vial die Zielsubstanz darstellt.

Die Identitätsmessung beantwortet eine andere Frage: Handelt es sich um die richtige Substanz? Auf aktuellen Berichten von BTLabs erfolgt dies mittels FTIR, einer Form der Infrarotspektroskopie. Das Spektrum der Probe muss die charakteristischen Absorptionsbanden des Peptids aufweisen. Viele andere Labore verwenden dafür Massenspektrometrie, welche die Masse des Moleküls misst und mit der theoretischen Masse vergleicht. Wie man ein solches Massenspektrum liest, einschließlich erwarteter und gemessener Masse, ist in Reinheit, HPLC und Massenspektrometrie beschrieben.

Diese beiden Messarten sind nicht austauschbar. Eine Probe kann zu 99 % rein sein und dennoch die falsche Verbindung enthalten: In diesem Fall bestehen 99 % des Inhalts aus einer einzigen Substanz, nur nicht aus der gesuchten Substanz. Ein Reinheitswert ohne begleitende Identitätsmessung sagt daher weniger aus, als es scheint.

Der Kopfbereich des Berichts: Welche Vial wurde getestet

Oben stehen die Daten, die den Bericht mit einer konkreten Probe verknüpfen. Lesen Sie diese zuerst, da alle darunter stehenden Angaben nur für diese Probe gelten.

• Report #: die Berichtsnummer von BTLabs selbst. Mit dieser Nummer verifizieren Sie den Bericht beim Labor.
• Lot Number: die Chargennummer der Charge. Diese Nummer sollte mit dem Etikett der Vial übereinstimmen, die Sie vorliegen haben.
• BT Sample ID: der interne Probencode des Labors.
• Testing material und Labeled as: die Bezeichnung der Substanz bei Einreichung und wie sie auf dem Etikett deklariert ist.
• Labeled Peptide Content: die Peptidmenge, die auf dem Etikett angegeben ist, beispielsweise 5 mg.
• Tested und Date: wann gemessen wurde und wann der Bericht erstellt wurde.
• Visual Description: wie die Vial eingegangen ist: Pulver, Etikett und Verschlusskappe.

Stimmt die Chargennummer nicht überein, betrachten Sie den Bericht einer anderen Charge, und er besitzt keine Aussagekraft für Ihr Material. Daher sind unsere Berichte unter Labberichte nach Chargennummer statt nur nach Substanzname durchsuchbar. Der Abgleich beginnt mit der Nummer auf dem Glas.

Die Prüftabelle, Zeile für Zeile

Das Kernstück des Berichts ist eine Tabelle mit vier Spalten: der Test, die Methode, die Spezifikation und das gemessene Ergebnis. Die Methodenspalte verweist auf ein Kapitel des US-amerikanischen Arzneibuchs (USP): die Standardmethode, mit der gemessen wurde.

• General Appearance: eine visuelle Prüfung. Die Spezifikation lautet beispielsweise "white powder", und das Ergebnis gibt an, ob die Probe dem entspricht.
• Mass: die Wägung der Füllung im Anlieferungszustand.
• FTIR Identification and Composition Analysis: die Identitätsmessung. Das Ergebnis bestätigt, ob das Spektrum zum Peptid passt, und gibt gegebenenfalls an, ob auch Hilfs- oder Füllstoffe im Pulver enthalten sind.
• HPLC Purity: die Reinheit in Prozent, mit der Spezifikation daneben, beispielsweise mindestens 98 %.
• HPLC Potency Assay: die Gehaltsbestimmung. Wie viel Milligramm Peptid sich tatsächlich in der Vial befinden, als absoluter Wert und als Prozentsatz der Etikettenangabe. Die Spezifikation liegt üblicherweise zwischen 90 und 110 % des deklarierten Werts.
• Peptide-to-Excipients Ratio: das Verhältnis zwischen Peptid und Hilfsstoffen im Pulver.

Reinheit und Gehalt werden häufig verwechselt, sind jedoch unterschiedliche Messwerte. Die Reinheit gibt an, welcher Anteil des Peptidmaterials die Zielsubstanz ist. Der Gehalt gibt an, wie viel von dieser Substanz sich in der Vial befindet. Eine Probe kann zu 99 % rein sein und dennoch weniger Milligramm enthalten als auf dem Etikett angegeben. Stehen dort beispielsweise 4,9 mg bei einem Etikettenwert von 5 mg, entspricht dies 98 % des deklarierten Werts.

Das Verhältnis zu den Hilfsstoffen erklärt, warum ein Pulver mehr wiegen kann als die reine Peptidmenge. Wer die Konzentration einer Stammlösung berechnet, legt den gemessenen Peptidgehalt zugrunde, nicht das Gewicht des Pulvers. Der Leitfaden zur Rekonstitution beschreibt, wie ein Lyophilisat gelöst wird.

Was ein HPLC-Chromatogramm zeigt

Ein Chromatogramm ist ein Diagramm mit der Zeit auf der horizontalen Achse und der Signalstärke auf der vertikalen Achse. Jede Substanz, die die Säule eluiert, erzeugt einen Peak. Der Zeitpunkt, an dem die Spitze eines Peaks erscheint, wird als Retentionszeit bezeichnet. Die Zielverbindung bildet in der Regel den größten Peak, und die Reinheit entspricht der Fläche dieses Peaks geteilt durch die Gesamtfläche aller Peaks. Eine Übersichtsarbeit von Mant und Kollegen (2007) beschreibt Reversed-Phase-HPLC als Standardtechnik für die Analyse synthetischer Peptide.

Kleine Nebenpeaks sind normal. Erwünscht ist ein schmaler, symmetrischer Hauptpeak und ein vernachlässigbarer Rest. Ein breiter oder doppelter Hauptpeak oder eine Schulter an der Flanke weist auf ein Gemisch hin, das von der Säule nicht sauber getrennt wird. Nebenpeaks in unmittelbarer Nähe des Hauptpeaks sind häufig verwandte Peptide: Varianten mit einer fehlenden Aminosäure, einer oxidierten Seitenkette oder einer anderen Abbauform. Der Übersichtsartikel von D'Hondt und Kollegen (2014) stellt diese Arten verwandter Verunreinigungen systematisch dar. Warum solche Varianten bei der Synthese entstehen, lesen Sie in Was sind Peptide.

Den Bericht selbst verifizieren

BTLabs verfügt über eine eigene Verifizierungsseite (verify.btlabtesting.com), auf der Sie die Report # eingeben und den Bericht direkt vom Labor abrufen können, ohne Zwischenschaltung des Verkäufers. Der Sinn einer Drittanbieteranalyse entfällt, wenn man sich auf das Wort des Lieferanten verlassen muss, dass dieser Drittanbieter existiert.

Eine praktische Vorgehensweise:

1. Lesen Sie die Chargennummer auf dem Etikett der Vial ab.
2. Suchen Sie den zugehörigen Bericht anhand der Chargennummer unter Labberichte.
3. Übernehmen Sie die Report # und prüfen Sie diese auf der Verifizierungsseite von BTLabs, oder öffnen Sie den Verifizierungslink beim Bericht.
4. Vergleichen Sie Substanzname, deklarierten Inhalt und Chargennummer zwischen Bericht, Verifizierung und Vial.

Dass dies kein überflüssiger Schritt ist, belegen wissenschaftliche Untersuchungen. Verbeke und Kollegen (2015) untersuchten synthetische Peptide, die mit einer Reinheit von mindestens 95 % deklariert waren. Weniger als die Hälfte erreichte diese Reinheit in ihrer eigenen Analyse, und in einer Probe wies die Hauptkomponente eine andere Struktur als das Zielpeptid auf. Ihre Schlussfolgerung lautete, dass Forschende sich nicht ungeprüft auf das Zertifikat des Lieferanten verlassen sollten.

Was ein Bericht nicht aussagt

Ein Chargenbericht bezieht sich ausschließlich auf den Inhalt einer Vial. Er trifft keine Aussagen über Wirkungen oder die Verwendung. Es handelt sich um ein Analysezertifikat, keine Packungsbeilage und keine Verwendungsempfehlung. BTLabs weist selbst darauf hin: Der Bericht enthält keine Angaben zu Partikeln, mikrobieller Kontamination oder Endotoxinen, und die Ergebnisse gelten nur für die getestete Probe im Anlieferungszustand.

Der Bericht beschreibt das trockene Pulver zum Zeitpunkt der Messung. Wie stabil das Peptid nach dem Öffnen oder Lösen bleibt, liegt außerhalb des Dokumentinhalts; dies wird in Peptide lagern behandelt.

Auch Gegenionen werden weitgehend nicht erfasst. Synthetische Peptide werden nach der Aufreinigung häufig als Salz geliefert, beispielsweise mit Trifluoracetat (TFA). Die HPLC-Reinheit betrachtet die Peptidpeaks, nicht dieses Salz. Für die Zellforschung kann dies relevant sein: Cornish und Kollegen (1999) stellten fest, dass TFA in niedrigen Konzentrationen die Proliferation von Osteoblasten und Chondrozyten in Zellkulturen hemmte.

Häufig gestellte Fragen

Warum befinden sich mehrere Nummern auf dem Bericht?

Die Report # dient der Verifizierung beim Labor. Die Lot Number identifiziert die Charge und muss mit dem Etikett Ihrer Vial übereinstimmen. Die BT Sample ID ist der interne Probencode des Labors.

Ist eine Reinheit von 98 % ausreichend?

Das hängt von der jeweiligen Fragestellung der Untersuchung ab. Der Bericht nennt die Spezifikation und den gemessenen Wert. Die verbleibenden Prozentanteile sind meist verwandte Peptide, deren genaue Identität nicht im Bericht aufgeführt ist; in empfindlichen Zellmodellen kann dies relevant sein.

Was ist der Unterschied zwischen Reinheit und Gehalt?

Die Reinheit ist der Anteil der Zielsubstanz am Peptidmaterial. Der Gehalt ist die Menge an Peptid in Milligramm in der Vial, bezogen auf die Etikettendeklaration.

Gibt der Bericht Auskunft über Sterilität?

Nein. Sterilität, Endotoxine und Partikel werden nicht gemessen, es sei denn, sie wurden separat getestet und sind im Bericht aufgeführt.

Quellen

1. Verbeke F, Wynendaele E, Braet S, D'Hondt M, De Spiegeleer B. Quality evaluation of synthetic quorum sensing peptides used in R&D. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29403929/
2. D'Hondt M, et al. Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25044089/
3. Mant CT, et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods in Molecular Biology, 2007. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18604941/
4. Cornish J, et al. Trifluoroacetate, a contaminant in purified proteins, inhibits proliferation of osteoblasts and chondrocytes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism, 1999. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10567002/