Reinheit, HPLC und Massenspektrometrie: zwei Messungen, zwei Fragen

Jeder Anbieter gibt einen Reinheitswert auf der Seite an. Der Wert allein ist nicht das Entscheidende: Die Frage ist, welche Messung ihm zugrunde liegt und was diese Messung feststellen kann. Zwei Analysen beantworten zwei verschiedene Fragen, und man benötigt beide. Im Folgenden: wie man ein Chromatogramm und ein Massenspektrum liest und wo die Grenzen eines Berichts liegen.

Was ein Prozentsatz eigentlich ausdrückt

Die Reinheit wird mittels HPLC bestimmt. Die Probe wird unter Druck durch eine Säule geleitet, welche die Bestandteile danach trennt, wie stark sie an das Säulenmaterial binden. Bei Peptiden ist das fast immer Reversed-Phase-HPLC: eine unpolare Säule und ein Eluent, in dem der Anteil des organischen Lösungsmittels schrittweise ansteigt. Was zuerst aus der Säule eluiert, bindet schwach; was später eluiert, bindet stärker. Ein UV-Detektor am Ende registriert, was passiert, meist bei einer Wellenlänge, bei der die Peptidbindung absorbiert. Die Übersichtsarbeit von Mant und Kollegen (2007) beschreibt diesen Aufbau als Standard für die Analyse und Aufreinigung synthetischer Peptide.

Das Ergebnis ist ein Chromatogramm mit Peaks. Die Reinheit entspricht der Fläche des Hauptpeaks geteilt durch die gesamte Peakfläche. Steht dort 99,4 %, bedeutet das: Von allem, was der Detektor erfasst hat, entfielen 99,4 % auf eine Substanz. Beachten Sie, was nicht in dieser Definition enthalten ist: um welche Substanz es sich handelt.

Ein Chromatogramm lesen

Auf der horizontalen Achse steht die Zeit in Minuten, auf der vertikalen die Signalstärke des Detektors. Drei Aspekte sind besonders beachtenswert.

Retentionszeit. Der Zeitpunkt, an dem das Maximum eines Peaks erscheint. Unter identischen Bedingungen (Säule, Eluent, Gradient, Temperatur) eluiert dieselbe Substanz stets zum etwa gleichen Zeitpunkt aus der Säule. Vergleicht man dies mit einem Referenzstandard, ist eine übereinstimmende Retentionszeit ein Hinweis auf die Identität, jedoch kein Beweis: Zwei verschiedene Peptide können nahezu gleichzeitig aus der Säule eluieren.

Peakfläche. Die Reinheit wird aus der Fläche unter den Peaks berechnet, nicht aus der Peakhöhe. Ein schmaler, hoher Peak und ein breiter, niedriger Peak können dieselbe Fläche aufweisen. Eine Software zieht eine Basislinie und integriert jeden Peak oberhalb eines definierten Schwellenwerts; wo diese Basislinie verläuft und welche kleinen Peaks mitgezählt werden, beeinflusst den Wert in der letzten Nachkommastelle.

Peakform. Ein guter Hauptpeak ist schmal und symmetrisch. Eine Schulter, ein ausgeprägtes Tailing oder ein Doppelpeak weisen darauf hin, dass unter dem Hauptpeak eine weitere Komponente koeluiert. Das ist der Schwachpunkt jedes HPLC-Prozentsatzes: Eine Verunreinigung, die exakt zeitgleich mit dem Peptid aus der Säule kommt, wird dem Hauptpeak zugerechnet. Eine Reinheitsangabe ist folglich bestenfalls so gut wie die chromatographische Trennung.

Kleine Peaks unmittelbar vor oder nach dem Hauptpeak sind häufig verwandte Peptide. Der Übersichtsartikel von D'Hondt und Kollegen (2014) fasst die bekannten Arten zusammen, darunter Varianten mit fehlenden oder zusätzlichen Aminosäuren, Oxidationen, Deamidierungen sowie Varianten mit gespiegelter Aminosäurekonfiguration. Wie Peptide aufgebaut werden und warum solche Varianten entstehen, lesen Sie in Was sind Peptide.

Warum Identität eine eigene Messung erfordert

Die Massenspektrometrie ionisiert das Molekül und misst das Masse-zu-Ladung-Verhältnis. Daraus resultiert ein Wert, der mit der theoretischen Masse der erwarteten Verbindung verglichen werden kann.

Für BPC-157 beträgt diese erwartete Masse 1419,5 g/mol; für das TB-500-Fragment Ac-LKKTETQ liegt sie bei 889,0 g/mol. Stimmt die gemessene Masse mit der erwarteten überein, ist dies ein starker Beleg dafür, dass es sich um die intendierte Substanz handelt. Weicht sie ab, liegt eine andere Substanz vor, unabhängig davon, wie rein sie ist.

Nicht jedes Labor bestätigt die Identität mittels Massenspektrometrie. Einige Berichte, darunter aktuelle Berichte von BTLabs, nutzen FTIR – eine Infrarotmessung, bei der das Spektrum der Probe die charakteristischen Banden des Peptids aufweisen muss. Wie Sie einen solchen Bericht Zeile für Zeile lesen, erfahren Sie in So lesen Sie einen BTLabs-Chargenbericht.

Ein Massenspektrum lesen

Auf der horizontalen Achse eines Massenspektrums steht m/z, die Masse geteilt durch die Ladung; auf der vertikalen die relative Intensität. Bei der Elektrospray-Ionisation, der gängigen Technik für Peptide, nimmt ein Molekül ein oder mehrere Protonen auf. Dadurch ist dasselbe Peptid häufig an mehreren Positionen im Spektrum zu sehen.

Beispiel BPC-157: Die monoisotopische Masse, berechnet aus der Sequenz, beträgt etwa 1418,7. Mit einem zusätzlichen Proton erwartet man das Ion [M+H]+ um m/z 1419,7; mit zwei Protonen [M+2H]2+ um m/z 710,4, da die Masse durch zwei geteilt wird. Beide Signale weisen auf dasselbe Molekül hin.

Beachten Sie auch den Unterschied zwischen durchschnittlicher und monoisotopischer Masse. Die durchschnittliche Masse (1419,5 g/mol) berücksichtigt die natürliche Isotopenverteilung; die monoisotopische Masse basiert ausschließlich auf den leichtesten Isotopen. Ein Bericht sollte ausweisen, welche der beiden gemeint ist. Wie nahe gemessene und erwartete Masse beieinander liegen müssen, hängt vom Instrument ab: bei einem einfachen Gerät wenige Zehntel einer Masseneinheit, bei hoher Auflösung wenige ppm.

Eine Abweichung lässt sich oft zuordnen. Eine Differenz von ca. +16 entspricht einer Oxidation, ca. +1 einer Deamidierung und −18 dem Verlust von Wasser. Ein Defizit in der Größe einer Aminosäure, wie etwa −57 für Glycin oder −97 für Prolin, deutet auf eine Deletionsvariante hin.

Addukte und Hintergrundsignale

Nicht jedes zusätzliche Signal in einem Spektrum stellt eine Verunreinigung in der Probe dar. Bei der Ionisation lagern sich leicht andere Ionen an das Peptid an, sogenannte Addukte. Die bekanntesten sind Natrium bei etwa +22 im Vergleich zu [M+H]+, Kalium bei etwa +38 und Ammonium bei etwa +17. Für BPC-157 wird ein Natriumaddukt somit um m/z 1441,7 erwartet.

Die Übersicht von Keller und Kollegen (2008) fasst derartige Störsignale und Hintergrundionen in der Massenspektrometrie zusammen, von Addukten bis hin zu Weichmachern und Lösungsmittelrückständen. Die Faustregel: Tritt ein zusätzliches Signal mit einer festen, bekannten Massendifferenz zum Hauption auf, handelt es sich wahrscheinlich um ein Addukt desselben Moleküls und nicht um eine zweite Substanz.

Was eine Verunreinigung in der Messung bewirkt

In der Forschung ist dies kein theoretischer Punkt. Eine Probe mit 90 % Reinheit, bei der fälschlicherweise von 99 % ausgegangen wird, ergibt eine Konzentration, die 10 % neben der Berechnung liegt. Das verschiebt eine Konzentrations-Wirkungs-Kurve, ohne dass die Ursache erkennbar ist.

Noch problematischer ist eine Verunreinigung, die im Versuchsmodell selbst aktiv ist. In diesem Fall misst man das Ansprechen auf zwei Substanzen und ordnet dieses einer einzigen zu. Das ist keine Messung mit etwas Rauschen, sondern die Messung eines anderen Phänomens. Dass dies in der Praxis vorkommt, zeigten Verbeke und Kollegen (2015): Von synthetischen Peptiden, die mit einer Reinheit von mindestens 95 % deklariert waren, erreichte bei eigener Analyse weniger als die Hälfte diesen Wert.

Auch der Abbau nach Erhalt spielt eine Rolle. Oxidation und Deamidierung entstehen nicht nur bei der Synthese, sondern auch bei der Lagerung, insbesondere in Lösung; siehe Peptide lagern.

Was wir veröffentlichen und was dies nicht darstellt

Zu den Chargen, für die ein Bericht vorliegt, veröffentlichen wir den vollständigen Bericht von BTLabs inklusive Chargennummer, sodass die Vial vor Ort dem Dokument zugeordnet werden kann. Über die Berichtsnummer und den Verifizierungslink lässt sich der Bericht direkt beim Labor überprüfen. Liegt für ein Produkt noch kein Bericht vor, ist vermerkt: „Chargenbericht folgt“. Alle Berichte finden Sie unter Labberichte.

Ein Bericht ist ein überprüfbares Datum, kein Versprechen. Er dokumentiert, was sich zum Zeitpunkt der Messung in der getesteten Vial befand. Sterilität, Endotoxine und Gegenionen sind nicht Gegenstand des Berichts, sofern sie nicht separat analysiert wurden. Er trifft keine Aussage über die biologische Wirkung der Substanz und stellt keine Anwendungsempfehlung dar; hierzu dient die wissenschaftliche Fachliteratur, die auf jeder Produktseite mit entsprechender PMID aufgeführt ist.

Häufig gestellte Fragen

Reicht eine hohe Reinheit aus, um die Identität festzustellen?

Nein. Die HPLC-Reinheit gibt an, welcher Anteil der Probe aus einer einzigen Substanz besteht, nicht jedoch, um welche Substanz es sich handelt. Hierfür ist eine separate Identitätsprüfung erforderlich, etwa mittels Massenspektrometrie oder FTIR.

Warum ist dasselbe Peptid an mehreren Stellen im Massenspektrum zu sehen?

Ein Peptid kann ein oder mehrere Protonen aufnehmen und Ionen wie Natrium oder Kalium binden. Jede dieser Formen erzeugt ein eigenes Signal. Liegen diese Signale in einer bekannten Massendifferenz zueinander, handelt es sich um dasselbe Molekül.

Wie stark darf die gemessene Masse von der erwarteten abweichen?

Das hängt vom verwendeten Instrument ab und davon, ob im Bericht die durchschnittliche oder die monoisotopische Masse verwendet wird. Bei einfacheren Instrumenten ist eine Abweichung von wenigen Zehnteln üblich, bei hochauflösenden Systemen von wenigen ppm. Größere Abweichungen mit einer festen Differenz, wie etwa +16 oder −18, deuten auf eine verwandte Variante hin.

Was bedeutet die Retentionszeit?

Es ist der Zeitpunkt, zu dem eine Substanz aus der Säule eluiert. Unter identischen Bedingungen ist diese Zeit reproduzierbar, was den Vergleich mit einer Referenz ermöglicht. Für sich allein belegt die Retentionszeit keine Identität.

Quellen

1. Mant CT, et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods in Molecular Biology, 2007. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18604941/
2. D'Hondt M, et al. Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25044089/
3. Keller BO, Sui J, Young AB, Whittal RM. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 2008. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18790129/
4. Verbeke F, Wynendaele E, Braet S, D'Hondt M, De Spiegeleer B. Quality evaluation of synthetic quorum sensing peptides used in R&D. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29403929/