Bakteriostatisches Wasser: Was es ist und warum es dazugehört

Fast jedes Peptid im Katalog wird als trockener Kuchen in einer Vial geliefert. Um im Labor damit zu arbeiten, muss dieser Kuchen in Lösung gebracht werden, und dafür ist bakteriostatisches Wasser das übliche Mittel. Der Unterschied zu gewöhnlichem sterilem Wasser liegt in einem einzigen Bestandteil. Im Folgenden wird erläutert, was dieser Bestandteil ist, was er bewirkt und was nicht, was die Forschung zur Proteinstabilität dazu aussagt und wie man ein angebrochenes Fläschchen lagert.

Zusammensetzung: Wasser mit 0,9 % Benzylalkohol

Bakteriostatisches Wasser ist steriles Wasser in Arzneibuchqualität, dem 0,9 % Benzylalkohol zugesetzt wurden. Mehr ist nicht enthalten: keine Salze, kein Puffer, keine sonstigen Hilfsstoffe.

Benzylalkohol ist ein kleiner aromatischer Alkohol, ein Benzolring mit einer Hydroxymethylgruppe. Er hat eine Molmasse von 108,14 g/mol und ist unter CAS 100-51-6 (PubChem CID 244) registriert. Er löst sich in dieser Konzentration vollständig in Wasser, wodurch die Flüssigkeit klar und farblos bleibt. Wer an einem geöffneten Fläschchen riecht, bemerkt mitunter einen schwachen, leicht süßlichen Geruch: Das ist der Benzylalkohol.

Was Benzylalkohol bewirkt und was nicht

Dieser Zusatz ist der Grund für die Existenz des Produkts. Benzylalkohol hemmt das Wachstum von Bakterien: bakteriostatisch, nicht bakterizid. Er tötet nicht ab, was bereits vorhanden ist, sondern hemmt, was hinzukommt. Dadurch bleibt ein angebrochenes Fläschchen länger verwendbar als steriles Wasser ohne Konservierungsmittel, das nach dem ersten Öffnen grundsätzlich für den Einmalgebrauch bestimmt ist.

Ein Übersichtsartikel von Meyer und Kollegen (2007) über Konservierungsmittel in sterilen Mehrdosenprodukten nennt Benzylalkohol neben Phenol als eines der am häufigsten verwendeten Konservierungsmittel in Peptid- und Proteinformulierungen, typischerweise in einer Konzentration von etwa 0,9 bis 1,1 %. Dieselbe Übersichtsarbeit beschreibt auch die Grenzen: Benzylalkohol ist gegen die meisten grampositiven Bakterien, Hefen und Pilze aktiv, jedoch weniger gegen gramnegative Bakterien. Das Konservierungsmittel ist somit ein Sicherheitsnetz, kein Ersatz für sauberes Arbeiten.

Der Unterschied zu sterilem Wasser

Auf den ersten Blick sind die beiden Flüssigkeiten identisch: klar, steril, partikelfrei. Der Unterschied liegt darin, was geschieht, nachdem das Fläschchen angebrochen wurde.

• Steriles Wasser enthält kein Konservierungsmittel. Nach dem ersten Öffnen gibt es nichts, was das Wachstum eingedrungener Mikroorganismen hemmt; es ist für den Einmalgebrauch bestimmt.
• Bakteriostatisches Wasser enthält 0,9 % Benzylalkohol und ist daher für mehrere Entnahmen aus demselben Fläschchen geeignet, sofern aseptisch gearbeitet wird.
• Andere Lösungsmittel, wie leicht angesäuertes Wasser, kommen bei Sequenzen in Betracht, die sich in neutralem Wasser schlecht lösen. Welches Lösungsmittel zu einem Produkt gehört, ist auf der Produktseite angegeben.

Steriles Wasser ist also nicht schlechter, sondern dient einem anderen Zweck: Es eignet sich für eine Lösung, die auf einmal verarbeitet wird, oder für eine Arbeitsvorschrift, in der ein Konservierungsmittel unerwünscht ist.

Benzylalkohol und Proteinstabilität

Ein Konservierungsmittel ist kein neutraler Zuschauer. In der Formulierungsforschung an größeren Proteinen wurde Benzylalkohol eingehend untersucht, und die Erkenntnisse sind wissenswert.

Zhang und Kollegen (2004) beschrieben anhand eines rekombinanten Proteins als Modell, wie Benzylalkohol in wässriger Lösung die Aggregation beschleunigte. Roy und Kollegen (2005) untersuchten dasselbe Protein in rekonstituierten lyophilisierten Formulierungen – also genau die Situation eines trockenen Pulvers, das mit einer konservierenden Lösung gelöst wird. Hutchings und Kollegen (2013) zeigten, dass Konservierungsmittel eine partielle Entfaltung eines Proteins verursachen können, wodurch es leichter aggregiert. Die Übersichtsarbeit von Meyer und Kollegen fasst es zusammen: Benzylalkohol kann an partiell entfaltete Proteine binden und deren Aggregation beschleunigen.

Was folgt daraus für kurze Peptide? Nicht automatisch dasselbe. Ein Peptid aus wenigen bis einigen Dutzend Aminosäuren weist meist keine gefaltete Struktur auf, die sich wie ein großes Protein entfalten könnte. Dennoch zeigt diese Forschung, warum die Wahl des Lösungsmittels stoffspezifisch bestimmt wird und nicht universell ist.

Warum das Pulver trocken geliefert wird

Peptide sind in Lösung weniger stabil als in trockener Form. Die Lyophilisierung, Gefriertrocknung, entzieht das Wasser unter Vakuum; das Eis geht direkt in Dampf über, anstatt zu schmelzen. Zurück bleibt ein poröser Kuchen, der bei −20 °C lange haltbar ist. Der Übersichtsartikel von Wang (2000) beschreibt ausführlich, warum dies für Proteine und Peptide der Standardweg zu einem stabilen Produkt ist und welche Schritte im Prozess selbst Schäden verursachen können.

Dieser Kuchen löst sich schnell auf, sobald Flüssigkeit hinzugefügt wird, eben weil er porös ist. Das ist der Vorteil der Gefriertrocknung gegenüber einfachem Eindampfen: Die Oberfläche bleibt groß. Wie ein Peptid aufgebaut ist und warum die Kette empfindlich gegenüber Wasser, Licht und Temperatur ist, steht in Was sind Peptide.

Wie man es hinzugibt

Der Kuchen ist mechanisch empfindlich. Flüssigkeit, die mit Kraft darauf trifft, kann die Peptidkette beschädigen, und Schaum bedeutet, dass Luft in der Lösung ist, die dort nicht hineingehört. Die empfohlene Vorgehensweise ist daher vorsichtig:

• Die Flüssigkeit an der Glaswand hinablaufen lassen, nicht direkt auf den Kuchen.
• Vorsichtig schwenken, bis alles gelöst ist. Nicht schütteln.
• Aseptisch arbeiten und das Septum beider Fläschchen desinfizieren: Das Konservierungsmittel hemmt das Wachstum, es macht Fehler nicht rückgängig.

Die vollständigen Schritte finden sich im Rekonstitutionsleitfaden; der Peptid-Rechner berechnet, wie viel Lösungsmittel für eine bestimmte Konzentration benötigt wird.

Lagerung

Für das Fläschchen bakteriostatisches Wasser selbst gilt: ungeöffnet bei Raumtemperatur und lichtgeschützt lagern. Nach der ersten Entnahme gehört das Fläschchen kühl, bei 2–8 °C und dunkel. Ist die Flüssigkeit trüb oder verfärbt oder enthält sie Partikel, wird sie nicht mehr verwendet.

Für ein gelöstes Peptid gelten strengere Regeln: bei 2–8 °C, dunkel und innerhalb des beim Produkt angegebenen Zeitraums. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen beschädigt die Kette; teilen Sie eine Lösung, die länger haltbar sein soll, daher in Aliquots auf. Die Hintergründe, von Kondenswasser bei einer kalten Vial bis zur Oxidation empfindlicher Aminosäuren, stehen in Peptide lagern.

Wofür es nicht bestimmt ist

Bakteriostatisches Wasser ist ein Laborreagenz. Es ist im Katalog enthalten, weil lyophilisiertes Material ein Lösungsmittel benötigt, nicht als Produkt mit eigener Anwendung. Benzylalkohol ist auch nicht in jeder Situation geeignet; es gibt Laboranwendungen, bei denen ein Konservierungsmittel ausdrücklich unerwünscht ist, beispielsweise Zellkulturen, die empfindlich auf Alkohole reagieren. Welche dies sind, hängt von der jeweiligen Arbeitsvorschrift ab.

Der Laborbericht gehört zum Peptid

Das Lösungsmittel ändert nichts daran, was sich in der Vial befand. Diese Frage beantwortet der Bericht von BTLabs beim Peptid selbst: eine HPLC-Reinheitsbestimmung und ein FTIR-Spektrum, das die Identität bestätigt, mit Lotnummer und einem Verify-Link, mit dem der Bericht beim Labor überprüft werden kann. Alle veröffentlichten Berichte stehen auf der Zertifikateseite. Der Bericht beschreibt den Trockenstoff zum Zeitpunkt der Testung; wie stabil eine Lösung danach ist, fällt nicht darunter. Und er stellt keine Gebrauchsanweisung dar.

Häufig gestellte Fragen

Kann steriles Wasser anstelle von bakteriostatischem Wasser verwendet werden?

Das ist möglich, wenn die Lösung auf einmal verarbeitet wird. Steriles Wasser enthält kein Konservierungsmittel, sodass nach dem Öffnen nichts das Wachstum von Mikroorganismen hemmt. Für eine Vial, aus der mehrmals entnommen wird, ist bakteriostatisches Wasser die übliche Wahl.

Tötet Benzylalkohol Bakterien ab?

Nein, nicht in dieser Konzentration. Benzylalkohol ist bakteriostatisch: Er hemmt das Wachstum, macht eine Kontamination jedoch nicht rückgängig. Zudem ist er gegen gramnegative Bakterien weniger aktiv, weshalb aseptisches Arbeiten weiterhin erforderlich bleibt.

Wie lagert man ein angebrochenes Fläschchen?

Nach der ersten Entnahme bei 2–8 °C und dunkel. Verwenden Sie die Flüssigkeit nicht mehr, wenn sie trüb oder verfärbt ist oder Partikel enthält.

Ist bakteriostatisches Wasser für jedes Peptid geeignet?

Für die meisten lyophilisierten Peptide im Katalog ja, jedoch nicht für alle. Manche Sequenzen lösen sich besser in einem anderen Lösungsmittel, und in manchen Arbeitsvorschriften ist ein Konservierungsmittel unerwünscht. Das passende Lösungsmittel ist auf der Produktseite angegeben.

Quellen

1. Meyer BK, Ni A, Hu B, Shi L. Antimicrobial preservative use in parenteral products: past and present. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2007. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17722087/
2. Zhang Y et al. Mechanism for benzyl alcohol-induced aggregation of recombinant human interleukin-1 receptor antagonist in aqueous solution. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2004. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15514986/
3. Roy S et al. Effects of benzyl alcohol on aggregation of recombinant human interleukin-1-receptor antagonist in reconstituted lyophilized formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2005. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15614819/
4. Hutchings RL et al. Effect of antimicrobial preservatives on partial protein unfolding and aggregation. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23169345/
5. Wang W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics, 2000. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10967427/