Lagerung von Peptiden: Lyophilisat, Lösung und Haltbarkeit im Labor

Ein Peptid, das bei Ankunft eine hohe Reinheit aufweist, kann nach einigen Wochen in einer schlecht gelagerten Lösung zu einem anderen Produkt geworden sein. Peptide sind Aminosäureketten, und diese Ketten sind empfindlich gegenüber Wasser, Sauerstoff, Licht und Temperaturschwankungen. Dieser Artikel beschreibt die gängige Laborpraxis für die Lagerung von lyophilisierten und gelösten Peptiden und erklärt die Hintergründe dieser Vorgehensweisen.

Lyophilisiertes Pulver: die stabilste Form

Die meisten Forschungspeptide werden als Lyophilisat geliefert: ein trockenes Pulver oder ein kompakter „Kuchen“, der durch Einfrieren der Lösung und Sublimieren des Wassers unter Vakuum entsteht. Eine Übersichtsarbeit von Butreddy und Kollegen (2021) im International Journal of Biological Macromolecules beschreibt, warum diese feste Form bevorzugt wird: Im trockenen Zustand nehmen sowohl der physikalische als auch der chemische Abbau im Vergleich zu flüssigen Formulierungen stark ab. Reaktionen, die Wasser erfordern, wie die Hydrolyse der Peptidkette und die Desamidierung von Asparagin und Glutamin, laufen ohne Wasser kaum ab. Dieselbe Übersichtsarbeit weist auch darauf hin, dass der Gefriertrocknungsprozess selbst Stress bedeutet; Einfrieren und Trocknen können Aggregation verursachen, weshalb Hersteller diesen Prozess sorgfältig optimieren.

Für das Labor bedeutet dies:

• Langfristig: Gängige Laborpraxis ist die Lagerung bei −20 °C oder kälter in einem dicht verschlossenen Vial.
• Kurzfristig: im Kühlschrank bei 2–8 °C.
• Transport: Kurze Zeiträume bei Raumtemperatur, wie beim Versand, werden von den meisten Lyophilisaten in der Praxis gut toleriert. Als dauerhafter Lagerort ist Raumtemperatur nicht geeignet.
• Dunkelheit: Vials in ihrer Box oder einem geschlossenen Behälter aufbewahren, nicht auf einer Fensterbank oder unter einer Lampe.

Feuchtigkeit: der unterschätzte Faktor

Ein Lyophilisat ist hygroskopisch: Es zieht Wasser aus der Luft an. Das größte Risiko entsteht in dem Moment, in dem ein kaltes Vial geöffnet wird. Es bildet sich sofort Kondensat auf dem Pulver, und dieses Wasser verbleibt nach dem Verschließen im Vial.

Die gängige Arbeitsweise besteht daher darin, das verschlossene Vial zunächst auf Raumtemperatur erwärmen zu lassen, vorzugsweise in einem Exsikkator oder einem geschlossenen Behälter mit Trockenmittel. Danach zügig arbeiten und das Vial sofort wieder verschließen. Einige Labore füllen den Kopfraum eines geöffneten Vials mit einem trockenen, inerten Gas wie Stickstoff oder Argon. Ein Pulver, das eingefallen, glasig oder klebrig wirkt, hat oft Feuchtigkeit aufgenommen; dies ist ein Grund, die Reinheit vor der weiteren Verwendung erneut bestimmen zu lassen.

Gelöste Peptide: kürzere Haltbarkeit

Sobald ein Peptid gelöst ist, beschleunigen sich die chemischen und physikalischen Abbauwege. Manning und Kollegen (2010) geben in Pharmaceutical Research eine Übersicht über diese Wege und über Methoden zur Stabilisierung von Proteinen und Peptiden sowohl in wässriger Lösung als auch im getrockneten Zustand. Eine Übersichtsarbeit von Zapadka und Kollegen (2017) in Interface Focus befasst sich speziell mit der Aggregation von Peptiden: dem Zusammenklumpen zu amorphen Aggregaten oder geordneten Fibrillen. Dieser Übersichtsarbeit zufolge hängt die Aggregation unter anderem von Sequenz, Konzentration, pH-Wert, Ladung, Oberflächenkontakt, Verunreinigungen, Temperatur, Schütteln und Lyophilisation ab.

Es gibt daher keine universelle Haltbarkeit für ein gelöstes Peptid. Gängige Laborpraxis ist:

• gelöste Peptide kurzfristig bei 2–8 °C zu lagern;
• für längere Zeiträume in Portionen zu teilen und bei −20 °C oder −80 °C einzufrieren;
• beim Lösen nicht heftig zu schütteln, sondern sanft zu schwenken oder zu rollen;
• die Lösung klar zu halten: Trübungen oder Partikel deuten auf Aggregation oder schlechte Löslichkeit hin.

Als Lösungsmittel wird häufig bakteriostatisches Wasser verwendet: steriles Wasser mit einer geringen Menge Benzylalkohol als Konservierungsmittel, das Bakterienwachstum hemmt, wenn dasselbe Vial mehrfach geöffnet wird. Mehr über die Zusammensetzung und die Unterschiede zu sterilem Wasser lesen Sie in unserem Artikel über bakteriostatisches Wasser. Die Schritte für das Lösen selbst finden sich im Leitfaden zur Rekonstitution. Hydrophobe Peptide lösen sich in Wasser mitunter schlecht und erfordern ein anderes Vorgehen; prüfen Sie hierzu die Produktinformationen.

Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden

Einfrieren scheint die sicherste Wahl zu sein, doch jeder Gefrier- und Auftauzyklus belastet das Peptid. Beim Einfrieren entstehen Eiskristalle; Peptid und gelöste Salze konzentrieren sich in der verbleibenden Flüssigkeit, und an der Grenzfläche zwischen Eis und Wasser können Moleküle entfalten oder zusammenklumpen. In manchen Puffern verschiebt sich zudem der pH-Wert während des Einfrierens.

Wie groß dieser Einfluss sein kann, zeigt eine Studie von Kueltzo und Kollegen (2008) im Journal of Pharmaceutical Sciences. Bei wiederholtem Einfrieren und Auftauen eines monoklonalen Antikörpers bildeten sich Aggregate, und zwar umso mehr, je niedriger der pH-Wert war. Auch das Behältermaterial machte einen großen Unterschied: In Teflon und in bestimmten kommerziellen Gefrierbehältern trat erheblich mehr Aggregation auf als in Kunststoff oder Glas. Ein Antikörper ist ein großes Protein, doch das zugrundeliegende Prinzip – Stress durch Konzentrierung und Grenzflächen – gilt auch für Peptide.

Aliquotieren: einmaliges Auftauen pro Portion

Die praktische Lösung ist das Aliquotieren: die Lösung direkt nach dem Lösen in kleine Portionen aufzuteilen, jeweils abgestimmt auf ein einzelnes Experiment. So wird jede Portion nur einmal aufgetaut und der Rest verbleibt unberührt im Gefrierschrank.

• Saubere, gut schließende Röhrchen oder Vials aus Glas oder Polypropylen verwenden; Peptide können an manchen Oberflächen adhärieren.
• Den Kopfraum klein halten, um den Kontakt mit Sauerstoff zu begrenzen.
• Die Portionen schnell einfrieren und an einem festen Platz im Gefrierschrank lagern, nicht in der Tür.
• Eine Portion auf Eis oder im Kühlschrank auftauen und Reste nach erneutem Einfrieren nicht wiederverwenden.

Oxidationsempfindliche Reste: Met, Cys und Trp

Nicht jedes Peptid ist gleich empfindlich. Sequenzen mit Methionin (Met), Cystein (Cys) oder Tryptophan (Trp) sind besonders anfällig für Oxidation. Methionin oxidiert zu Methioninsulfoxid, Cystein kann unerwünschte Disulfidbrücken bilden, und Tryptophan liefert diverse Oxidationsprodukte und ist zudem lichtempfindlich.

Ji und Kollegen (2009) untersuchten dies im Journal of Pharmaceutical Sciences anhand eines Modellproteins. Sie identifizierten und quantifizierten die Oxidation von Methionin, Tryptophan und Histidin unter verschiedenen oxidierenden Bedingungen. Freies Methionin in der Lösung schützte vor der Oxidation durch Wasserstoffperoxid, und eine Kombination aus Tryptophan und Methionin bot Schutz vor mehreren Arten von Oxidation.

Für Peptide mit diesen Resten ist die gängige Praxis: Sauerstoff begrenzen (Inertgas, kleiner Kopfraum, gegebenenfalls entgastes Lösungsmittel), dunkel in Braunglas-Vials oder Aluminiumfolie aufbewahren und kalt lagern. In einer massenspektrometrischen Analyse ist eine Oxidation oft als zusätzliches Signal erkennbar, das um 16 Dalton schwerer ist als die erwartete Masse – ein zusätzliches Sauerstoffatom.

Beschriftung und Dokumentation

Eine fachgerechte Lagerung steht und fällt mit einer soliden Dokumentation. Ein Vial oder Röhrchen ohne Etikett ist in einem geteilten Gefrierschrank nach wenigen Wochen unbrauchbar. Auf jedes Etikett gehören mindestens:

• Name des Peptids und Chargennummer;
• Konzentration und Lösungsmittel;
• Datum des Lösens und Initialen;
• Lagertemperatur.

Verwenden Sie gefrierfeste Etiketten oder einen wasserfesten Stift und führen Sie zusätzlich ein Logbuch, in dem pro Charge notiert wird, wann sie gelöst wurde, in wie viele Portionen und wo diese gelagert sind. Verknüpfen Sie dieses Logbuch mit der Chargennummer auf dem Analysebericht, damit stets nachvollziehbar ist, zu welcher Reinheitsmessung eine Portion gehört.

Der Labbericht und die Lagerung

Der Analysebericht von BTLabs auf der Produktseite beschreibt das Produkt zum Zeitpunkt der Analyse. Er enthält eine HPLC-Bestimmung der Reinheit und ein FTIR-Spektrum, das die Identität bestätigt, verknüpft mit einer Chargennummer, die über den Verify-Link überprüft werden kann. Alle Berichte sind auf der Seite Zertifikate zu finden. Ob diese Reinheit erhalten bleibt, hängt danach davon ab, wie das Material gelagert wird. Der Bericht ist eine Analyse von Identität und Reinheit, keine Gebrauchsanweisung. Lösen Sie ein Lyophilisat daher vorzugsweise erst dann, wenn die Untersuchung es erfordert; bakteriostatisches Wasser finden Sie beim Laborzubehör.

Häufig gestellte Fragen

Wie lange ist ein lyophilisiertes Peptid haltbar?

Das hängt von der jeweiligen Sequenz ab, aber trocken, dunkel und bei −20 °C oder kälter ist ein Lyophilisat in der Regel erheblich länger stabil als ein gelöstes Peptid. Feuchtigkeit ist der größte Störfaktor: Lassen Sie ein kaltes Vial immer erst auf Raumtemperatur kommen, bevor Sie es öffnen.

Darf ein gelöstes Peptid wieder in den Gefrierschrank?

Ein einmaliges Einfrieren ist üblich, wiederholtes Einfrieren und Auftauen nicht. Teilen Sie die Lösung daher direkt in Portionen auf, sodass jede Portion nur einmal aufgetaut wird.

Warum BAC-Wasser und nicht einfach steriles Wasser?

BAC-Wasser enthält Benzylalkohol, der das Bakterienwachstum hemmt, wenn dasselbe Vial mehrfach geöffnet wird. Steriles Wasser ohne Konservierungsmittel eignet sich für Lösungen, die auf einmal verarbeitet werden. Manche Peptide erfordern ein anderes Lösungsmittel.

Wie erkennt man, ob ein Peptid abgebaut ist?

Trübung, Partikel oder ein zusammengesunkenes, klebriges Pulver sind Hinweise, doch viele Abbauprozesse sind mit dem bloßen Auge nicht erkennbar. Gewissheit bringt nur eine erneute Analyse, beispielsweise mittels HPLC und Identitätsprüfung.

Quellen

1. Butreddy A, Janga KY, Ajjarapu S, Sarabu S, Dudhipala N. Instability of therapeutic proteins - An overview of stresses, stabilization mechanisms and analytical techniques involved in lyophilized proteins. International Journal of Biological Macromolecules, 2021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33275971/
2. Manning MC, Chou DK, Murphy BM, Payne RW, Katayama DS. Stability of protein pharmaceuticals: an update. Pharmaceutical Research, 2010. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20143256/
3. Zapadka KL, Becher FJ, Gomes Dos Santos AL, Jackson SE. Factors affecting the physical stability (aggregation) of peptide therapeutics. Interface Focus, 2017. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29147559/
4. Kueltzo LA, Wang W, Randolph TW, Carpenter JF. Effects of solution conditions, processing parameters, and container materials on aggregation of a monoclonal antibody during freeze-thawing. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17823949/
5. Ji JA, Zhang B, Cheng W, Wang YJ. Methionine, tryptophan, and histidine oxidation in a model protein, PTH: mechanisms and stabilization. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2009. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19455640/